尖锐湿疣基因诊断方法

    迄今为止，感染尖锐湿疣的HPV病毒难于用传统的病毒培养及血清学技术检测，主要实验诊断技术是核酸杂交。近年来发展的PCR方法具有特异、敏感、简便、快速等优点，为HPV检测开辟了新途径。

　　(一)标本的采集及处理

　　标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。标本核酸的提取，按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液37℃下处理过夜;

　　(二)PCR扩增

　　1、 引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区(E)和晚期区(L)，每区含一系列开放读码框架(ORF)。

　　2、PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶(2U/ml)、10mmol/L dNTP贮备液，10×PCR缓冲液，100μmol/L MY11和MY09贮备液，灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。

　　3、PCR扩增方法和程序：以100μl PCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。

　　(三)扩增产物的检测和分析

　　1、凝胶电泳：扩增反应结束后，取出反应管，冷却至室温，取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪下分析结果，分子量约为450bp处出现明显的DNA带。

　　2、核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时，可用标记的公用混合探针和(或)型特异探针作Southern吸印杂交、斑点杂交验证。

　　用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果，可检出标本中200个拷贝的HPV DNA，若以核酸杂交检测PCR产物，敏感性提高，能检出10个拷贝的HPV DNA。

　　鉴于PCR技术的高度敏感性，以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求，避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。一般情况下，PCR扩增产物经凝胶电泳，观察产生的DNA可直接作出诊断。因此，PCR技术检测HPV实验周期短、简便快速。