如何测定蛋白质的含量

凯氏定氮法利用强酸消化使蛋白质氮成铵盐，碱性蒸馏氨被硼酸吸收用标准酸滴定算氮含量再经换算得蛋白质含量，不同样品消化条件需适配，不同年龄样本采集要符特点且除干扰物；双缩脲法是碱性中铜离子与肽键络合显色，比色测，不同蛋白质肽键结构影响显色，不同年龄人群体液本底和组成不同要考虑，需除游离氨基酸等干扰；紫外吸收法依酪氨酸和色氨酸在280nm特征吸收，吸光度与浓度正比，要校正核酸干扰，不同年龄人群体液核酸含量和蛋白质组成不同，要除核酸等杂质；Bradford法靠考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合变色，吸光度与浓度线性，不同蛋白质结合能力有差异，不同生活方式人群样本要具代表性，特殊人群要防蛋白质变性。

一、凯氏定氮法

1.原理：利用强酸（如浓硫酸）消化样品，使蛋白质中的氮转化为铵盐形式，随后在碱性条件下蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收氨，再以标准酸溶液滴定，根据酸的消耗量计算氮含量，再通过蛋白质含氮量的换算系数（一般蛋白质含氮量约为16%，故换算系数为6.25）得出蛋白质含量。

2.操作要点及影响因素：不同样品的消化条件需适配，如食品与生物组织的消化时间、温度等可能因样品特性而异；年龄方面，儿童与成人的体液或组织中蛋白质含量及组成有差异，检测时需确保样本采集符合对应年龄特点；若样品含干扰物质，需提前处理以保证氮转化完全。

二、双缩脲法

1.原理：在碱性环境中，铜离子与蛋白质分子中的肽键发生络合反应，生成紫色络合物，该络合物在540nm波长处有特征吸光度，通过比色法测定吸光度可计算蛋白质含量。

2.操作要点及影响因素：不同蛋白质的肽键结构差异会影响显色程度，如某些含特殊肽键结构的蛋白质可能导致显色偏差；对于不同年龄人群，其体液（如儿童的脑脊液、血液等）中蛋白质本底及组成不同，检测时需考虑样本的特异性；需排除样本中其他物质（如游离氨基酸等）的干扰。

三、紫外吸收法

1.原理：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm波长处有特征紫外吸收峰，其吸光度与蛋白质浓度成正比，通过测定280nm处的吸光度可估算蛋白质含量。

2.操作要点及影响因素：核酸等杂质在260nm和280nm处均有吸收，会干扰测定，需通过计算核酸的干扰校正值来提高准确性；不同年龄人群的体液或组织中核酸含量及蛋白质组成不同，如儿童的细胞代谢活跃程度与成人有别，可能影响紫外吸收的背景值；检测时需确保样本中核酸等杂质已被有效去除。

四、Bradford法

1.原理：考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，颜色由红色变为蓝色，在595nm波长处的吸光度与蛋白质浓度呈线性关系，据此可定量蛋白质。

2.操作要点及影响因素：不同蛋白质与考马斯亮蓝G-250的结合能力存在差异，如富含碱性氨基酸的蛋白质结合能力可能更强；不同生活方式人群的蛋白质摄入情况不同，样本采集时需保证代表性；对于儿童等特殊人群，需注意样本处理过程中避免蛋白质变性等影响结合效果的因素。