如何分析免疫组化蛋白的表达

免疫组化包括样本获取处理、抗原修复（热修复及酶消化法）、免疫组化染色（一抗二抗孵育、显色发光）、结果判读（染色强度、阳性细胞比例及临床意义），还涉及年龄采集需轻柔、性别样本来源有差异、生活方式影响病理状态及蛋白表达、病史会干扰结果判读。

一、样本制备

1.样本获取：需获取合适的组织样本，如手术切除的肿瘤组织、活检组织等，样本应保证新鲜或经妥善固定，常用甲醛固定以维持组织细胞形态结构，不同组织类型固定时间有差异，例如实体肿瘤组织一般固定6~24小时。

2.样本处理：将固定后的组织进行包埋、切片，制成厚度适宜（通常3~5μm）的组织切片，便于后续染色操作。

二、抗原修复

1.修复原因：甲醛固定会掩盖抗原表位，需通过抗原修复使抗原重新暴露，常用方法有热修复和酶消化法。

2.热修复：采用柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）进行高温高压处理，一般在高压锅中100~121℃处理10~15分钟，可有效暴露多数抗原表位；也可采用水浴加热方式，将切片置于缓冲液中60~95℃加热15~30分钟。

3.酶消化法：使用胰蛋白酶或胃蛋白酶等消化酶处理切片，根据抗原性质选择合适酶及消化时间，如胰蛋白酶常用浓度0.1%~0.2%，消化时间5~15分钟，适用于部分不耐热抗原的修复。

三、免疫组化染色步骤

1.一抗孵育：选择针对特定蛋白的一抗，按说明书要求稀释后与组织切片孵育，孵育温度一般为37℃，时间0.5~2小时，使一抗与靶蛋白特异性结合。

2.二抗孵育：使用与一抗对应的二抗，二抗带有标记物（如酶标记、荧光标记等），孵育条件同一抗，通常37℃孵育0.5~1小时，二抗与一抗结合以放大信号。

3.显色或发光：若为酶标记二抗，使用相应底物显色，如辣根过氧化物酶标记的二抗可使用DAB底物显色，呈现棕色；若为荧光标记二抗，则利用荧光显微镜观察荧光信号。

四、结果判读

1.染色强度：分为阴性（无染色）、弱阳性（浅黄色）、阳性（棕黄色）、强阳性（深棕色）等，需在显微镜下观察切片不同区域的染色情况进行判断。

2.阳性细胞比例：一般分为阴性（阳性细胞比例<5%）、弱阳性（5%~50%）、阳性（50%~75%）、强阳性（>75%），通过计数不同区域阳性细胞占总细胞数的比例来确定。

3.临床意义：不同蛋白的表达情况具有不同临床意义，例如在肿瘤诊断中，某些蛋白（如HER-2）的表达情况可辅助判断肿瘤类型、恶性程度及预后等，年龄方面儿童样本采集需更轻柔以保证样本质量，避免因创伤影响样本有效性；性别对免疫组化基本步骤无直接影响，但样本来源可能因性别存在差异；生活方式相关疾病可能影响样本病理状态及蛋白表达解读；病史中自身免疫性疾病等可能干扰免疫组化结果判读，需综合分析。