如何进行蛋白组分析

样本采集依类型规范操作，不同年龄人群有别，特殊疾病状态等需明病史；样本制备中蛋白提取据类型选裂解液并依人群调条件，蛋白纯化用亲和层析法；蛋白定量用BCA法，注意样本稀释度；蛋白分离有二维电泳和液相色谱并依人群调参数；蛋白鉴定用质谱技术并考虑病史影响；数据分析用生物信息学软件经数据库功能注释和通路分析，考虑相关因素统计分析保结果可靠。

一、样本采集

样本采集需依样本类型规范操作。组织样本选取具代表性部位，采集后迅疾处理，若长时保存置-80℃速冻；体液样本如血液需选适配抗凝剂避溶血，尿液样本防污染保纯净。不同年龄人群样本采集有别，儿童样本量依体重控，老年人群操作轻柔减组织损伤；性别无特殊差异，特殊疾病状态下需明病史；长期饮酒者血液蛋白成分异，采集告之生活方式；患代谢病者体液等蛋白谱异常，采集明病史助综合考量。

二、样本制备

1.蛋白提取

据样本类型选裂解液，细胞样本用含蛋白酶抑制剂裂解液，如动物细胞用RIPA裂解液，低温（4℃左右）振荡或超声使细胞充分裂解，防蛋白变性。儿童样本裂解条件温和，老年样本蛋白易聚集，调超声时间等。

2.蛋白纯化

存杂质时用亲和层析法纯化，如组氨酸标签蛋白用镍离子亲和柱，经平衡、上样、洗涤、洗脱得较纯目标蛋白，严控实验条件保蛋白完整性与活性。

三、蛋白定量

BCA法为常用，原理是试剂与肽键反应成紫色复合物，测吸光度算浓度。配标准蛋白溶液系列绘标准曲线，样本与试剂混合孵育后测吸光度，据曲线算浓度。注意样本稀释度，高蛋白饮食人群调稀释比例。

四、蛋白分离

1.二维电泳

第一向等电聚焦依等电点分离，样本加含两性电解质凝胶电场下移至等电点；第二向SDS-PAGE依分子量分离，胶条放含SDS凝胶电场下按分子量分，调电压电流等条件。老年样本蛋白分子量分布有特点，调电泳参数。

2.液相色谱分离

反相高效液相色谱用疏水性固定相，流动相为水与有机溶剂梯度洗脱，依理化性质分离蛋白，优化流动相条件适配不同生活方式人群蛋白组成。

五、蛋白鉴定

质谱技术为关键，MALDI-TOF-MS将分离蛋白点酶解成肽段，肽段溶液与基质涂布靶板，激光照射离子化，飞行时间质谱测分子量并数据库比对。考虑不同病史蛋白修饰差异，保鉴定准确性。

六、数据分析

用生物信息学软件，经GO数据库功能注释（分子功能、生物过程、细胞组分），KEGG数据库通路分析，分析蛋白在疾病通路变化。考虑不同年龄、性别、生活方式、病史影响，统计分析并数据校正保结果可靠。